常用的主流蛋白提取方法
蛋白提取是分子生物学、细胞生物学和蛋白质组学研究的基础步骤，不同的样本类型（细胞、组织、体液等）和下游应用（Western Blot、质谱分析、ELISA等）需要不同的提取方法。以下是主流的蛋白提取技术及其适用场景：
一、总蛋白提取（Total Protein Extraction）
适用于大多数常规实验（如Western Blot、ELISA）。
1. RIPA裂解法（最常用）
裂解液成分：
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RIPA Buffer（含Triton X-100/SDS/脱氧胆酸钠）
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蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA、cocktail）
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磷酸酶抑制剂（如NaF、Na3VO4，用于磷酸化蛋白研究）
步骤：
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细胞/组织加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。
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离心（12,000 rpm, 4℃, 15 min），取上清（蛋白溶液）。
优点：
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裂解能力强，适用于大多数蛋白。
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兼容后续WB、IP等实验。
缺点：
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可能破坏蛋白复合物（因含SDS）。
2. NP-40/Triton X-100裂解法（温和裂解）
适用：膜蛋白、蛋白相互作用研究（如Co-IP）。
裂解液：
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1% NP-40 或 Triton X-100
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Tris-HCl (pH 7.4) + NaCl + 蛋白酶抑制剂
特点：
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比RIPA温和，能保留蛋白复合物。
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适合可溶性蛋白提取，但可能漏掉部分难溶蛋白。
3. 尿素/硫脲裂解法（适用于难溶蛋白）
适用：
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包涵体蛋白、膜蛋白、纤维蛋白（如角蛋白）。
裂解液： -
8M 尿素 + 2M 硫脲 + DTT（还原剂）
特点：
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强变性剂，可溶解难溶蛋白。
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常用于蛋白质组学（2D电泳）。
二、亚细胞组分蛋白提取
用于研究特定细胞器（如核蛋白、线粒体蛋白等）。
1. 核蛋白与胞浆蛋白分离
试剂盒：NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit（Thermo）
步骤：
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细胞用低渗缓冲液裂解（胞浆蛋白释放）。
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离心后沉淀（含细胞核）用高盐缓冲液提取核蛋白。
应用：
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转录因子分析（如NF-κB）。
2. 线粒体蛋白提取
方法：
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差速离心法（低速去细胞碎片→高速沉淀线粒体）。
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试剂盒（如Mitochondria Isolation Kit, Abcam）。
应用：
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凋亡研究（检测Cytochrome C释放）。
三、特殊样本蛋白提取
1. 组织样本
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机械破碎：匀浆器、研磨珠（如TissueLyser）。
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液氮研磨（适用于坚硬组织，如肌肉、植物）。
2. 血清/血浆蛋白
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避免高丰度蛋白干扰：
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用Depletion Kit去除白蛋白/IgG（如ProteoPrep®）。
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直接稀释后检测（如ELISA）。
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3. 植物蛋白提取
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TCA-丙酮法：去除多糖、多酚干扰。
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酚抽提法：适用于蛋白质组学。
四、蛋白提取注意事项
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低温操作：全程冰上防止蛋白降解。
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蛋白酶抑制剂：必须添加（尤其长时间提取）。
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避免反复冻融：分装保存蛋白样品。
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定量检测：BCA/Bradford法测浓度。
五、不同实验的推荐提取方法
| 实验目的 | 推荐方法 |
|---|---|
| Western Blot | RIPA裂解法 |
| Co-IP/ChIP | NP-40/Triton裂解法（温和） |
| 磷酸化蛋白研究 | RIPA + 磷酸酶抑制剂 |
| 膜蛋白提取 | 尿素/硫脲裂解或去垢剂（如DDM） |
| 蛋白质组学 | 尿素/硫脲 + 2D电泳兼容缓冲液 |
总结
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RIPA裂解：最通用，适合总蛋白提取（WB等）。
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NP-40/Triton：温和，适合蛋白互作研究。
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尿素/硫脲：溶解难溶蛋白（包涵体、膜蛋白）。
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亚细胞组分：需特定分离方法（如核蛋白、线粒体蛋白）。
根据样本类型和下游实验选择合适方法，并严格控制实验条件以确保蛋白完整性和活性！
