Western Blot（蛋白质免疫印迹）是检测特定蛋白表达和定量的重要技术，但实验结果常受多种因素影响（如背景高、条带模糊、信号弱等）。以下是高质量WB实验的关键步骤和优化策略，涵盖样本准备、电泳、转膜、抗体孵育和检测全流程。
一、实验前的准备
1. 样本制备（关键！）
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蛋白提取：
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使用合适的裂解液（如RIPA用于总蛋白，NP-40用于温和裂解）。
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添加蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA等）和磷酸酶抑制剂（如研究磷酸化蛋白）。
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定量：BCA或Bradford法确保上样量一致（通常20-50 μg/孔）。
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样本处理：
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煮沸5-10分钟（含SDS上样缓冲液）充分变性。
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避免反复冻融（分装保存于-80℃）。
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2. 凝胶选择
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SDS-PAGE凝胶：
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根据蛋白分子量选择凝胶浓度（如10%用于10-200 kDa蛋白）。
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小分子蛋白（<20 kDa）用高浓度胶（12-15%），大分子（>150 kDa）用低浓度胶（6-8%）。
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预制胶 vs 自制胶：
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预制胶（如Bio-Rad）方便且重复性好，但成本高。
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自制胶需确保无气泡、凝固均匀（APS/TEMED新鲜配制）。
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二、电泳（SDS-PAGE）
1. 上样技巧
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Marker：必加！推荐预染Marker（如PageRuler™）方便监测电泳进程。
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上样量：
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避免超载（条带拖尾）或不足（信号弱）。
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高丰度蛋白（如GAPDH）可减少上样量（10 μg）。
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上样缓冲液：含SDS和DTT（或β-巯基乙醇）确保蛋白充分还原。
2. 电泳条件
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电压：
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浓缩胶：80-100 V（使蛋白压成一条线）。
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分离胶：120-150 V（根据蛋白大小调整时间）。
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降温：冰浴或低温电泳槽防止过热导致条带扭曲。
三、转膜（关键步骤！）
1. 膜的选择
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PVDF膜：
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高结合能力，需甲醇激活（浸泡15秒）。
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适合低丰度蛋白，可重复使用（如 stripping后重孵育）。
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NC膜（硝酸纤维素膜）：
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无需激活，背景低，但易碎。
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2. 转膜方法
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湿转法：
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标准条件：100 V, 60-90 min（冰浴降温）。
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大分子蛋白（>100 kDa）建议延长转膜时间或降低电压。
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半干转法：
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快速（15-30 min），但易发热，适合小分子蛋白。
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3. 转膜后验证
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丽春红染色：快速检查转膜是否均匀（可水洗掉）。
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考马斯亮蓝染色胶：确认蛋白已完全转出。
四、封闭与抗体孵育
1. 封闭（减少非特异结合）
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封闭液：
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5%脱脂牛奶（成本低，但可能含磷酸酶干扰磷酸化蛋白）。
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5% BSA（适合磷酸化蛋白或生物素化抗体）。
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时间：室温1小时或4℃过夜（避免过长导致信号减弱）。
2. 一抗孵育
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稀释比例：参考说明书（常用1:1000，需优化）。
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孵育条件：
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4℃过夜（特异性高）或室温2小时（快速但可能背景高）。
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洗膜：TBST（Tris+吐温20）洗3次，每次5-10分钟。
3. 二抗孵育
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选择：HRP或荧光标记二抗（如抗小鼠/兔IgG-HRP）。
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稀释比例：1:5000-1:10000（高稀释减少背景）。
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时间：室温1小时（避光孵育荧光二抗）。
五、检测与优化
1. 化学发光法（ECL）
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步骤：
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混合ECL A/B液（1:1），均匀覆盖膜。
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曝光（避免过度曝光导致条带饱和）。
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优化：
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短曝光（10 s）和长曝光（5 min）结合捕捉不同丰度蛋白。
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使用低背景ECL试剂（如SuperSignal™）。
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2. 荧光检测（避免HRP缺陷）
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适用：多重WB（如不同荧光标记二抗检测多个蛋白）。
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设备：需荧光扫描仪（如Odyssey）。
3. 内参选择
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常用内参：
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胞浆蛋白：GAPDH、β-actin。
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核蛋白：Lamin B1、Histone H3。
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全细胞蛋白：β-tubulin。
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注意：内参分子量需与目标蛋白分开（避免重叠）。
六、常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 无信号 | 一抗失效/转膜失败 | 验证抗体、丽春红检查转膜 |
| 高背景 | 封闭不足/二抗浓度过高 | 延长封闭时间、降低二抗稀释比 |
| 条带拖尾 | 蛋白超载/胶未凝固 | 减少上样量、确保胶充分聚合 |
| 非特异条带 | 抗体交叉反应 | 更换抗体或增加封闭剂 |
| 条带扭曲 | 电泳过热/气泡 | 冰浴降温、排除凝胶气泡 |
七、实验设计建议
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设立对照：
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阳性对照（已知表达样本）和阴性对照（敲除/敲低样本）。
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重复实验：至少3次独立重复确保可重复性。
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数据定量：用ImageJ等软件分析条带灰度值（归一化至内参）。
总结
高质量WB的关键在于：
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样本制备标准化（裂解充分、定量准确）。
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电泳与转膜优化（凝胶浓度、转膜条件匹配蛋白大小）。
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抗体选择与封闭（高特异性抗体，合适封闭剂）。
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检测方法匹配（化学发光/荧光，避免过曝）。
通过严格优化每一步，可显著提高WB的重复性和可靠性！
