以下是针对表观遗传学测序技术（BS测序、ATAC-seq、DAP-seq）的详细介绍，涵盖原理、实验流程、数据分析及应用场景：
1. 表观测序（Epigenomic Sequencing）概述
表观遗传学研究不改变DNA序列的基因表达调控机制，主要包括DNA甲基化、染色质开放性和蛋白质-DNA互作等。相关测序技术如下：
2. BS测序（Bisulfite Sequencing）
原理
-
通过亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化C保持不变，测序后识别甲基化位点。
-
全基因组BS测序（WGBS）：覆盖全基因组甲基化，单碱基分辨率。
-
简化代表性BS测序（RRBS）：富集CpG密集区域，降低成本。
实验流程
-
DNA处理：亚硫酸氢盐转化→纯化。
-
建库测序：Illumina平台（需双端测序）。
-
数据分析：
-
比对（Bismark、BSMAP）。
-
甲基化水平计算（甲基化率 = 支持甲基化的reads数/总reads数）。
-
应用场景
-
癌症甲基化标志物筛查（如抑癌基因启动子高甲基化）。
-
发育生物学（如胚胎发育过程中的甲基化重编程）。
优缺点
-
优点：单碱基精度、全基因组覆盖。
-
缺点：亚硫酸盐处理导致DNA降解，需高深度测序（≥30X）。
3. ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using Sequencing）
原理
-
利用Tn5转座酶切割开放染色质区域，测序分析染色质可及性（开放区域通常为调控元件）。
实验流程
-
细胞处理：裂解细胞核→Tn5酶切→片段回收。
-
建库测序：PCR扩增后Illumina测序（50 bp短读长）。
-
数据分析：
-
峰值检测（MACS2）。
-
注释到启动子/增强子（HOMER）。
-
应用场景
-
鉴定细胞类型特异性调控元件（如神经元分化中的开放染色质动态）。
-
结合转录组（RNA-seq）揭示基因表达调控机制。
优缺点
-
优点：所需细胞量少（500~50,000个细胞），高灵敏度。
-
缺点：易受线粒体DNA污染（需生物信息学过滤）。
4. DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing）
原理
-
体外表达转录因子（TF）并与基因组DNA片段孵育，通过亲和纯化富集TF结合位点后测序。
实验流程
-
TF表达：原核系统（如E. coli）表达带标签（如His-tag）的TF。
-
DNA结合：与基因组DNA片段孵育→磁珠纯化结合DNA。
-
测序分析：比对峰值（类似ChIP-seq）。
应用场景
-
植物TF结合位点鉴定（如拟南芥抗旱相关TF）。
-
无抗体依赖的TF-DNA互作研究（适合难以制备抗体的TF）。
优缺点
-
优点：无需抗体、适用于非模式生物。
-
缺点：体外系统可能忽略体内表观修饰（如甲基化）的影响。
技术对比
| 技术 | 检测目标 | 分辨率 | 样本要求 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| WGBS | DNA甲基化 | 单碱基 | 高纯度DNA | 全基因组甲基化图谱 |
| ATAC-seq | 染色质开放性 | 150-500 bp区域 | 新鲜细胞/冻存核 | 调控元件挖掘 |
| DAP-seq | TF-DNA结合位点 | ~200 bp峰值 | 体外合成TF | 无抗体TF研究 |
联合分析策略
-
多组学整合：
-
WGBS + ATAC-seq：揭示甲基化与染色质开放的关联（如肿瘤中甲基化沉默的增强子）。
-
DAP-seq + RNA-seq：验证TF调控的下游靶基因。
-
注意事项
-
样本质量：
-
ATAC-seq需新鲜细胞避免核破裂。
-
WGBS需完整DNA（降解样本推荐RRBS）。
-
-
数据分析：
-
甲基化数据需批次效应校正（如ComBat）。
-
ATAC-seq峰值注释需参考基因组注释文件（如GENCODE）。
-
应用案例
-
医学：WGBS发现结直肠癌中特定CpG岛的甲基化特征。
-
植物学：DAP-seq鉴定水稻抗旱转录因子OsNAC10的结合位点。
-
发育生物学：ATAC-seq追踪小鼠胚胎干细胞分化中的染色质动态。
这些技术为解析基因表达调控提供了多维度工具，根据研究目标（甲基化、开放性或TF结合）和样本类型选择合适方法。
